顯然，CT值取決于域值。域值的量化定義是基線(xiàn)范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。實(shí)驗(yàn)操作中，域值范圍定義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整(前2個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)太弱，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大；而在CT值前3個(gè)循環(huán)大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開(kāi)始增強(qiáng)，超過(guò)了基線(xiàn)高度)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀(guān)地看到，隨著PCR反應(yīng)過(guò)程，熒光信號(hào)從基線(xiàn)經(jīng)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)進(jìn)入指數(shù)期、線(xiàn)性期和終的平臺(tái)期，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對(duì)固定的。如果用不同濃度模版DNA作PCR，可以看出模版濃度越高，CT值越小。模版濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。　　　　

 

    模板定量可分為相對(duì)定量和定量。定量指的是用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)推算未知的樣本的量。質(zhì)粒DNA常作為定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來(lái)轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來(lái)確定。相對(duì)定量指的是在樣本中目標(biāo)序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化。即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法或者比較CT法進(jìn)行相對(duì)定量，前者和定量相似，后者運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來(lái)反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內(nèi)參照的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)?！　　　?/div>